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調(diào)試和校準(zhǔn)

流式細(xì)胞儀在使用前，流式細(xì)胞儀調(diào)試和使用甚至在使用過程中都要精心進(jìn)行調(diào)試,，以保證工作的可靠性和最佳性,。調(diào)試的項目主要是激光強(qiáng)度,、液流速度和測量區(qū)的光路等。

激光強(qiáng)度：除調(diào)整反射鏡的角度以調(diào)整到所需波長的激光出光外,，還要結(jié)合顯示屏上的光譜曲線使激光的強(qiáng)度輸出為最大,。

液流速度：可通過操作臺數(shù)字顯示監(jiān)督，調(diào)節(jié)　氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度,。

測量區(qū)光路調(diào)節(jié)?。哼@是調(diào)試工作的關(guān)鍵。需要保證在測量區(qū)的液流,、激光束,、90散射測量光電系統(tǒng)垂直正交，而且交點(diǎn)較小,。一般可在用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球等校準(zhǔn)中完成,。

流式細(xì)胞術(shù)中所測得的量是相對值，因此需要在使用前或使用中對系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)或標(biāo)定,，這樣才能通過相對測量獲得絕對的意義,。因而FCM中的校準(zhǔn)具有雙重功能：儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)該穩(wěn)定,，有形成份形狀應(yīng)是大小比較一致球形,，樣品分散性能良好，且經(jīng)濟(jì),、容易獲得,。常用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品，雞血紅細(xì)胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品,。微球用樹脂材料制作,，或標(biāo)有熒光素，或不標(biāo)記熒光素,。所用的雞血紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制作過程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血（抗凝劑：雞血=1：4）,，經(jīng)PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細(xì)胞混合,，室溫下振蕩醛化24h,，最后經(jīng)PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用,。流式細(xì)胞儀調(diào)試和使用需要指出的是因為未經(jīng)熒光染色,，所測光信號為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光。

儀器的操作和使用

1)打開電源,，對系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱,；

2)打開氣體閾，調(diào)節(jié)　壓力,，獲得適宜的液流速度,；開啟光源冷卻系統(tǒng)；

3)在樣品管中加入去離子水,，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng),；

4)利用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器,，使在激光功率,、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上,，0和90散射的熒光強(qiáng)度最強(qiáng),，并要求變異系數(shù)為最小,；

5)選定流速,、測量細(xì)胞數(shù)、測量參數(shù)等,，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品,；同時選擇計算機(jī)屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，從而能直觀掌握測量進(jìn)程,；

6)樣品測量完畢后,，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；

7)因為實驗數(shù)據(jù)已存入計算機(jī)硬盤（有的機(jī)器還備有光盤系統(tǒng),，存貯量更大）,，因此可關(guān)閉氣體、測量裝置,，而單獨(dú)使用計算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,；

8)將所需結(jié)果打印出來。

操作和使用中的注意事項

1）光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件,，暴露的較強(qiáng)的光線下以后,，需要較長時間的“暗適應(yīng)”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽,；

2）光源不得在短時間內(nèi)（一般要1h左右）關(guān)上又打開,；使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；

3）液流系統(tǒng)必需隨時保持液流暢通,，避免氣泡栓塞,，所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過過濾、消毒,；

4）注意根據(jù)測量對象的變換選用合適的濾片系統(tǒng),、放大器的類型等；

5）特別強(qiáng)調(diào)每次測量都需要對照組,。